“高维超分辨成像”技术

　　细胞是生命的基本单位，内部结构复杂而精密。每一个细胞都像一座微型城市，拥有“发电厂”（线粒体）、“物流中心”（高尔基体）、“垃圾处理站”（溶酶体）、“信息高速公路”（内质网）等多种细胞器。看清这些细胞器的结构和动态，一直是科学家面临的巨大挑战。近年来，随着超分辨成像技术和人工智能的飞速发展，北京大学的科研团队与合作者联合开发出一种全新的“高维超分辨成像”技术，成功实现了对活细胞内15种细胞器的同时成像与精准识别，为细胞生物学研究打开了一扇全新的大门。
 　 从“看不到”到“看得到”
　　细胞器种类繁多，个头又很小。有多小呢？以我们熟悉的涮羊肉为例，一片羊肉的厚度大约2—3毫米，是细胞尺寸的200—300倍。如果我们有“庖丁解牛”的技艺，能够将这片羊肉持续切出200片，那么就能得到一个细胞厚度的样品。可以想象，这片“薄如蝉翼”的肉将是高度透明的。样品越薄，其吸光度越低，整体呈现指数衰减——这就是著名的比尔定律。在高度透明的细胞中，每个细胞器都更薄、更透明，也更加难以观察。
　　要观察透明的细胞，一个简单的方法就是给所要观察的细胞或细胞器染色，即“病理染色”。用苏木素-伊红染色法对10微米左右厚度的组织切片进行染色，我们可以在显微镜下看到细胞核呈深蓝黑色，肌肉组织和细胞呈不同程度的粉红色。但是，当我们进行活细胞观察时，这个方法就有些力不从心了。活细胞往往只能吸收极低浓度的染料，高浓度染料会影响细胞的正常功能，甚至将细胞毒死。
　　科学家想到可以让吸收染料的细胞器主动发光，这就是目前生命科学研究中常用的荧光成像技术：通过开发专门识别某一类细胞器的荧光染料，让这种细胞器主动发光，从而研究它的形态与功能。
 　 从“看不清”到“看得清”
　　传统的光学显微镜受限于光的衍射极限，只能看到约200纳米以上的结构，大约是可见光波长的1/2。
　　电子显微镜能看得更清楚。电子具有质量，其物质波波长极短，因此具有非常高的分辨率。但电子显微镜看不了“活”细胞——当我们将细胞放在电镜下，用电子对其进行轰击前，首先需要抽真空，通过高真空环境让电子能够顺利地到达细胞。而活细胞含水丰富，在真空中会迅速脱水死亡。同时，高能电子束的能量达到几百电子伏特，会直接电离生物分子，造成不可逆损伤。此外，在电子显微镜成像前，样品必须经过固定、脱水、重金属染色等复杂步骤，彻底破坏细胞活性。
　　为了既得到高分辨率的图像，又保持细胞活性，还要能够看到特定的细胞器，科学家将目光重新投向光学显微镜。
　　通过不同的物理原理，科学家开发了多种超分辨成像技术，如结构光照明显微镜（ SIM）、受激发射损耗显微镜（ STED）和单分子定位显微镜（ PALM/STORM）等。这些技术通过不同的物理机制，突破了光学衍射极限，将分辨率提升至几十纳米甚至更高。
 　 从“看得清”到“看得多”“看得准”“看得深”
　　荧光成像技术通 过特异性染色，对不同的细胞器进行标记，只要正确区分这些标记，就能对细胞器进行成像。
　　这个方法很快就遇到了一个问题：细胞里有30多种细胞器，如果采用特异性荧光染色法，由于每种荧光的光谱都很宽，会相互串扰（信号混叠），所以无法对4种以上的细胞器进行准确区分。
　　为了解决串扰问题，哥伦比亚大学教授闵伟利用一些光谱极窄的拉曼染料，实现了多种细胞器的标记与成像；诺贝尔奖得主Eric Betzig通过探测器的光谱探测，让混叠在一起的荧光信号能够被准确区分，从而实现6种细胞器的成像。
　　这两种方案也有各自的不足：拉曼染料一次只能关注一个通道，导致多细胞器成像需要的时间非常长，不适合研究多细胞器同时互作；而光谱解耦的方式需要将光分到不同的探测通道，造成光子利用率低，能区分的细胞器少。
　　那么，如何能“看得多”呢？
　　为了实现多种细胞器同时成像，研究团队另辟蹊径：假设有一种染料可以进入研究者所有感兴趣的细胞器，进去后，可以自己判断进入了什么“房间”，根据细胞器的特性实现变色。这样，它就能发出五颜六色的光，研究者可以通过区别这些颜色，来实现多种细胞器同时成像。
　　为了实现这一“天马行空”的想法，研究团队找到了一种染料“中等生”——尼罗红。它是一种通用的脂溶性染料，科研人员在研究有膜细胞器时往往会用到它。这种染料可以标记细胞内所有的膜结构，但它的特异性不强，无法被准确分辨，成像往往一片模糊。
　　尼罗红有一些特别的性质：它的发光特性会随着所处环境的极性和脂质相态而变化。例如，在极性较高的膜环境中，尼罗红的发光会红移；而在非极性环境中则会蓝移，从而报告细胞器的化学“极性”。此外，尼罗红的荧光偏振特性也会因脂质膜的有序程度而发生变化：当细胞器中含有更多甘油磷脂时，尼罗红对偏振调制呈现高速随机的分子转动，无法观察到偏振响应；而细胞器中排列致密的鞘磷脂与胆固醇则能够限制其转动，让我们看到偏振响应，从而报告细胞器的物理“序性”。
　　为了解决成像模糊的问题，研究团队结合荧光结构光超分辨显微技术，开发出了一种名为“光谱偏振光学断层成像”（SPOT）的新技术。SPOT 技术通过同时捕捉尼罗红的发光强度、光谱和偏振信息，构建出细胞器的“光学指纹”，实现了对细胞器形态、极性和相态的多维度解析。
　　那么，如何能“看得准”呢？
　　研究团队进一步构建了一种名为AttentionU-Net的神经网络模型，将每种带有细胞器特异性荧光标记的图像作为训练数据，教会AI如何根据尼罗红的“光学指纹”识别不同的细胞器。
　　经过训练，AI模型可以精准地区分 15种细胞器结构。这种AI模型具有强大的迁移学习能力，能够在不同细胞系、不同显微镜平台，甚至活体组织中保持高准确率，展现出极强的通用性和实用性。
　　研究团队还解决了“看得深”难题——SPOT技术仅需单一染料染色，结合超分辨成像与AI分析，便可在活体组织中实现多细胞器成像。研究团队成功实现了在果蝇幼虫精巢等生物样品中的活细胞多细胞器超分辨动态互作网络解析。这一突破为研究活体组织中的细胞器功能、发育过程和疾病机制，提供了全新的研究范式。
　　（图文据《光明日报》2025年9月11日第16版，有删节）